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    蛋白質純化方法經典攻略(四)
  • 發布日期:2022-03-18     信息來源:      瀏覽次數:1244
    • 那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下關于蛋白質純化方法經典攻略(四):


      蛋白質洗脫方法

      固定相上結合的蛋白質要用可破壞結合作用力的溶劑條件進行洗脫。這些流動相的條件要根據層析類型和目標蛋白質的性質來選擇。蛋白質洗脫方法通常包括以下三種:批次洗脫,階梯式洗脫和線性梯度洗脫。如何選擇*好的方法要依靠采用的層析方式和所需的分離效果來決定。
      1、批次洗脫 - 一步即將所有結合蛋白質一次性洗脫?;谔禺愋韵嗷プ饔?(如親層析)的層析方法*好采用這種方式。批次洗脫法沒有任何分離效果,但它可以很好地快速去除雜質。它需要事先了解取代目標蛋白所需的緩沖液條件。
      2、階梯式洗脫 - 連續進行多步批次洗脫,并每次逐漸增強洗脫條件。在階梯式洗脫中,收集的組分數取決于連續批次洗脫的次數。階梯式洗脫比批次洗脫的分離效果要好,但比線性梯度洗脫的效果要差。
      3、線性梯度洗脫 - 當流動相以線性梯度洗脫時可收集多種連續流出的組分。對于離子交換層析和疏水作用層析,線性梯度洗脫可以獲得*好的分離效果,同時,它還可以收集到大量的連續組分。
      由于體積排阻層析中蛋白質和固定相之間不存在相互作用,因此不需要采用任何一種上述洗脫方法。蛋白質上樣后,無需改變洗脫緩沖液的條件,即可連續不斷地收集各分離組分至所有蛋白質全部被洗脫為止理想的情況是這根層析柱所采用的洗脫緩沖液同樣可用于后續的層析柱,由此可省去兩步之間必須的緩沖液置換或者透析操作。

      其它色譜方法

      羥基磷灰石(羥基磷酸鈣)是*初在20世紀50年代中期描述的蛋白質純化技術。球形羥基磷灰石的商業可得性使羥基磷灰石柱色譜法成為可及的技術。蛋白質與羥基磷灰石柱相互作用的機制是復雜的。蛋白質*常用磷酸鹽梯度洗脫。羥基磷灰石與其他色譜技術具有不同的選擇性,因此可以對有難度的蛋白純化或作為*終“拋光"步驟提供有效補充。羥磷灰石層析已經成功地用于治*療級抗體的純化。
      色譜聚焦是一種基于其pI分離蛋白質的柱層析法。蛋白質結合到專門的離子交換介質上并用pH梯度洗脫。色譜聚焦的選擇性不同于其他技術的選擇性,因此可用作*終的“拋光"步驟。

      組分純度分析

      每一次柱層析分離完成后,收集的組分必須進行分析以檢測其所含的目標蛋白及各組分的相對純度。每一步之后都需要進行該類分析以確定哪些組分可以被合并用于下一步。為檢測純度,必須有一種方法能檢測出某種特定蛋白質相對所有蛋白質的含量。下列即為一些常用于純度分析的方法:
      1、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) - 一種基于蛋白質尺寸不同來進行分離的變性凝膠。市售染色劑可使樣品中所有蛋白質顯色可見,可據此對蛋白質進行純度分析(圖10)。SDS-PAGE不能對組分進行大規模的分析,并且需要耗費數小時。但由于易操作、經濟且適用于所有蛋白,因此它仍然是一種*常用采用的方法。

      圖 10. 蛋白質純化工藝中收集的蛋白質樣品的SDS-PAGE檢測結果。

      2、光譜分析 - 一種分析蛋白質光學性質的方法。這種用于蛋白質純度分析的方法只適用于如細胞色素P450等具有*光學特征的蛋白質。這一類蛋白質在某特定波長(420 nm附近 [40] )有吸收而其他蛋白質沒有,因此比較它在420nm和280nm處 (該波長處所有蛋白質均有吸收) 的吸收,即可獲得該蛋白質的純度信息。這個方法快速且可大規模操作,但僅使用于部分蛋白質。
      3、蛋白質測活 - 一種目標蛋白的酶活實驗。這種測定蛋白質純度的方法通常與其他蛋白質濃度測定方法相結合以計算其相對整體蛋白質濃度的活性?;钚詼y試只適用于活性可以被高通量方法如酶解測活的蛋白質。對某些蛋白質而言,活性測試提供了一種快速可靠的蛋白質檢測方法。酶的測活是非常有用的,因為這樣在下一步應用前即可先將失活的蛋白質排除出去。

      純化后蛋白保存

      當蛋白質純度已滿足實驗研究的要求時,即可將其以合適的方式保存起來。*終保存用緩沖液的選擇和純化過程中選擇所用的緩沖液一樣重要,同樣依賴于蛋白質的穩定性和純化蛋白質后續應用所需條件來選擇。通常,因為在SEC層析過程中可以完成緩沖液的有效置換,因此它通常被安排為整個純化工藝的*后一步。純化的組分可以立即合并保存,或者*后合并的組分也可以透析為所選的緩沖液后再保存。
      由于蛋白質的保存條件取決于目標蛋白本身,應將其優化至能長期保持蛋白質結構和功能穩定性的條件。在儲存條件下,保存緩沖液中通常會加入一些添加劑用于延長純化蛋白的保存期。由于每種蛋白質的表現各不相同,因此需要通過多次實驗來尋找*合適的保存條件。

      膜蛋白

      細胞產生的約20-30%的蛋白質是整合膜蛋白,并且約50%的小分子藥*物作用于膜蛋白質。因此,針對解決膜蛋白結構有極大的興趣。純化整合膜蛋白的關鍵步驟是它們從脂質雙層的溶解,同時保留其功能完整性。典型的方法包括通過離心分離細胞內膜,隨后洗滌劑溶解整合膜蛋白質并高速離心以除去不溶性膜殘余物。
      大量的洗滌劑已被用于膜蛋白溶解,并且在沒有文獻或實驗室先例的情況下,研究者將需要憑經驗確定某特定蛋白質的*佳洗滌劑。然后通過本質上與可溶性蛋白相同的柱色譜法純化溶解的膜蛋白。然而,純化緩沖液將需包含洗滌劑以保持蛋白質處于可溶狀態。膜蛋白的純化通常非常具有挑戰性,因為在從脂質雙層初步移除和通過各種純化步驟后蛋白質功能完整性和聚集的常常喪失。近來,納米盤已經成功地用于B家族GPCR的親和純化。
      無論是蛋白研究還是應用,通常需要將蛋白利用不同的生物系統表達出來,然后進行分離和純化。研究實驗室通常需要純化微克或毫克級別的蛋白質,而工業上需要純化數千克甚至數噸的蛋白質。因此,蛋白純化非常重要。純化過程中,主要需要考慮宿主污染、樣品的可溶性、蛋白結構的完整性和生物活性。分享了以上蛋白純化的方法,希望對大家工作有所幫助。
      以上就是上海金鵬分析儀器有限公司為大家整理總結蛋白質純化方法經典攻略(四)。
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